由于細胞壁等因素的限制,植物的單細胞研究要稍晚于動物領域,目前植物單細胞文章主要是針對少量單細胞轉錄組異質性的研究,高通量水平還未應用到植物領域。2019年2月4日,美國密歇根大學John Schiefelbein實驗室在線發表了擬南芥高通量單細胞轉錄組(scRNA)研究文章,發表雜志為Plant Physiology(IF=5.949),這也是第一篇將10x Genomics scRNA測序應用在植物中的發表文獻。
植物10x Genomics scRNA-seq一個很大的限制因素是無法獲得高活力的原生質體,下面給出了上述文獻中擬南芥根組織原生質體的制備流程,供參考,實際操作時需要根據研究的組織類型,對實驗條件進行優化,例如解離酶的選擇、解離酶的處理時間等。
1、溶液準備
清洗液:0.4 mM 甘露醇(Mannitol)、20mM MES (pH 5.7)、20 mM KCl、10mM CaCl2、0.1% (w/v) BSA;
酶解液:1.25% (w/v) 纖維素酶Cellulase("ONOZUKA" R-10, Yakult)、0.1% (w/v)果膠酶Pectolyase (P-3026, Sigma-Aldrich)、0.4 mM Mannitol、20mM MES (pH 5.7)、20 mM KCl、10mM CaCl2、0.1% (w/v) BSA。
2、原生質體懸液制備
1) 取擬南芥根尖,切碎,70-μm濾器過濾;
2) 置于35 mm培養皿中,加入酶解液;
3) 放入恒溫搖床(85 rpm),25°C酶解1h;
4) 500 g 離心10 min;
5) 離心,加入500 μL清洗液洗滌;
6) 40μm細胞濾器過濾原生質體懸液后,200g離心 6 min;
7) 清洗液重懸,確定原生質體濃度,冰上放置,可進行10x上機標記。